Genome Editing ist eine Art neuer Züchtungstechnik, die durch programmierbare sequenzspezifische Nukleasen (SSN) vermittelt wird. SSNs sind Enzyme, die kleine DNA-Brüche verursachen, die, wenn sie von der Zelle repariert werden, je nach dem bei der Reparatur verwendeten molekularen Mechanismus Mutationen verschiedener Art erzeugen können. Die Besonderheit der SSN für die Züchtung liegt in unserer Fähigkeit, sie mit hoher Präzision so zu programmieren, dass sie an bestimmten Stellen des Pflanzengenoms landen und dort ihre Aktivität ausüben. Dies, zusammen mit den zahlreichen genomischen und phänomenalen Informationen, die in den letzten Jahren sowohl in Modellpflanzen als auch in Nutzpflanzen generiert wurden, führt zu einer fast unbegrenzten Fähigkeit zur Erzeugung neuer genetischer Variabilität, die auf Bereiche des Genoms „gerichtet“ wurde, die zuvor aufgrund ihres funktionellen Interesses identifiziert wurden. Diese neue „gerichtete“ Variabilität, die von SSNs erzeugt wird, kann sowohl verwendet werden, um neues Basiswissen zu erlangen als auch neue Merkmale von agronomischem Interesse zu generieren. In diesem zweiten Aspekt ist die Palette der Verwendungen und Anwendungen von SSN bei der Verbesserung von Pflanzen riesig, von der Züchtung von Resistenz gegen biotischen und abiotischen Stress, zur Steigerung der Produktivität, zur Verbesserung des Nährstoffgehalts usw.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Typen programmierbarer SSN entdeckt. Auf Proteinen des Zinkfingertyps (ZFNs) basierende SSNs sind seit den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt. In jüngerer Zeit wurden die auf TAL-Effektoren basierenden SSNs entwickelt, die zu einem qualitativen Effizienzsprung gegenüber ihren Vorgängern beitrugen. In beiden Fällen basiert die „Programmierung“ auf der Kombination mehrerer Proteinmodule nach einem zuvor aufgeklärten Code, was eine de novo-Modifikation eines multimodularen Proteins für jedes genomische Target erfordert. Obwohl die Entwicklung neuer Strategien für die Synthese und den Zusammenbau von DNA-Stücken die Produktion rekombinanter Proteine stark erleichtert hat, ist die Programmierung von SSN mit Codes basierend auf der Kombination von Proteinmodulen aufwendig, teuer und für viele Labore nicht verfügbar.
Der Paradigmenwechsel bei der Verwendung von SSNs fand mit dem Erscheinen eines neuen Werkzeugs statt, das auf dem erworbenen bakteriellen Immunitätssystem CRISPR basiert, das von Francis Mojica von der Universität Alicante in Spanien entdeckt und benannt wurde. Im Gegensatz zu seinen Vorgängern erfordert die Programmierung des CRISPR-Systems nicht die Neukonstruktion multimodularer Proteine, sondern lediglich die Generierung einer kleinen RNA-Sequenz komplementär zum genomischen Ziel, die in ein invariables Protein (Cas9) eingebaut wird und als Guide (Guide-RNA oder gRNA), um sein genomisches Ziel zu erreichen. Die Einfachheit des CRISPR / Cas9-Programmiercodes erleichtert dessen Design und Konstruktion erheblich, was es vielen Labors und Endbenutzern ermöglicht, neue spezifische „Eigenschaften“ zu züchten. Darüber hinaus ermöglicht die CRISPR/Cas9-Architektur die gleichzeitige Programmierung mehrerer Ziele (ein als Multiplexing bekanntes Merkmal), was die Anhäufung phänotypischer Merkmale erleichtern und Verbesserungsprozesse erheblich beschleunigen könnte.
Im Allgemeinen gibt es drei genetische Editierungsstrategien basierend auf CRISPR / Cas9, je nach Art der in das Genom eingebrachten Modifikationen.
Die in Pflanzen am häufigsten verwendete Strategie ist die sogenannte SSN-1-Strategie, die darin besteht, kleine zufällige Mutationen (Indels: Insertionen oder Deletionen) als Folge von DNA-Bruch in der Zielsequenz und anschließender fehlerhafter Reparatur durch den Mechanismus namens NHEJ . zu erzeugen (Vereinigung von nicht-homologen Enden). Diese Strategie hat sich bei mehreren Arten als sehr effizient erwiesen und zielt darauf ab, durch den Funktionsverlust der mutierten Gene neue Charaktere zu induzieren. Die als SSN-2 bekannte Strategie bietet ihrerseits eine größere Präzision, da sie buchstäblich darin besteht, eine kleine Genomregion umzuschreiben, die vordefinierte Änderungen enthält, die in einer „Donor“-DNA-Sequenz verschlüsselt sind, die zusammen mit der SSN in das Genom übertragen wird. Dazu wird eine alternative Art der zellulären Reparatur, die sogenannte homologe Rekombination, verwendet, die das Genom mithilfe einer externen DNA-Matrize repariert. Schließlich ähnelt die SSN-3-Strategie der SSN-2, ihr Ziel besteht jedoch nicht darin, kleine „Reparaturen“ einzuführen, sondern „neue genetische Informationen“ in präzise Genomstellen einzubauen und die Freizügigkeit der HR-Reparatur zur Aufnahme von Spendern zu nutzen Sequenzen, dass sie in ihrer Zentralregion nicht-homologe Regionen enthalten. Sowohl das SSN-2 als auch das SSN-3 (auch als genetische Targeting-Strategien oder GT bekannt) erweitern den Bereich der genetischen Variabilität, um Funktionen zu verbessern, und bieten einen qualitativen Sprung in der Art von Merkmalen, die durch diese Strategien erhalten werden können. Allerdings waren Strategien, die auf homologe Rekombination basieren, in Pflanzen bis vor kurzem ineffizient, was dazu führte, dass viele der bisher getesteten Ansätze vom Typ „Loss of Function“ (SSN-1) sind.
In allen Fällen ist es für die genomische Bearbeitung unabdingbar, das SSN-Enzym (zum Beispiel Cas9) zusammen mit der gRNA und gegebenenfalls der DNA des Spenders, die das „ neue“ „genetische Sequenz einzuführen (SSN-2 und SSN-3), um anschließend aus der Zelle oder den bearbeiteten Zellen eine komplette Pflanze zu regenerieren. Der am häufigsten verwendete Mechanismus zur Einführung dieser Elemente in die Zelle ist die durch Agrobacterium vermittelte genetische Transformation. Das Ergebnis ist vorübergehend eine transgene Pflanze, die jedes einzelne der oben genannten Elemente enthält und exprimiert. In einem späteren Schritt kann jedoch bei Pflanzen, die sich sexuell vermehren, die T-DNA durch sexuelle Segregation eliminiert werden, wodurch nicht-transgene Pflanzen entstehen, die die gewünschte genetische Bearbeitung enthalten.
Aus bioethischer Sicht und unter strikter Beachtung des Endprodukts erzeugen die Strategien SSN-1 und SSN-2 Pflanzen, die praktisch nicht von denen durch traditionelle Züchtungsmethoden zu unterscheiden sind und daher nicht als GVO betrachtet werden sollten. Die SSN-3-Strategie würde ihrerseits unweigerlich zu GVO führen, allerdings mit größerer Präzision genau an der Stelle des Genoms, in die die zusätzliche genetische Information eingebracht wurde.
In Bezug auf die bioethischen und regulatorischen Implikationen wurden kürzlich erfolgreich alternative Mechanismen getestet, um den Ribonukleoproteinkomplex (Cas9 + RNAg) direkt in den Zellkern von Protoplasten verschiedener Pflanzenarten einzuführen, wodurch die Verwendung von Zwischenprodukten in Form von DNA vermieden wird. Auf diese Weise wird der Bearbeitungsprozess vollständig dem Prozess der chemischen Mutagenese (letztere von der Regulierung der OMG ausgenommen) gleichgestellt, so dass die resultierenden Pflanzen als nicht transgen vermarktet werden können.