新的植物育种技术

基因组编辑

基因组编辑是一种由可编程序列特异性核酸酶 (SSN) 介导的新育种技术。 SSN 是导致 DNA 小断裂的酶,当它被细胞修复时,根据修复中使用的分子机制,可以产生各种类型的突变。应用于育种的 SSN 的特殊性在于我们有能力对它们进行高精度编程,以便它们落在植物基因组的特定位点并在那里发挥作用。这一点,连同近年来在模式植物和作物中产生的丰富的基因组和表型信息,转化为几乎无限的能力来产生新的遗传变异性,“定向”到先前通过其功能兴趣确定的基因组区域。这种由 SSN 产生的新“定向”变异既可用于获得新的基础知识,也可用于产生新的农艺性状。在这第二个方面,SSN 在植物改良中的用途和应用范围是巨大的,从对生物和非生物胁迫的育种抗性到提高生产力、改善营养含量等。
近年来,已经发现了不同类型的可编程 SSN。自上世纪 90 年代以来,人们就已经知道基于锌指型 (ZFN) 蛋白质的 SSN。最近,开发了基于 TAL 效应器的 SSN,与之前的产品相比,这在效率方面实现了质的飞跃。在这两种情况下,“编程”都基于根据先前阐明的代码组合多个蛋白质模块,这需要对每个基因组目标的多模块蛋白质进行从头修饰。尽管用于合成和组装 DNA 片段的新策略的开发极大地促进了重组蛋白的生产,但使用基于蛋白质模块组合的代码对 SSN 进行编程既费力又昂贵,而且许多实验室无法使用。
SSN 使用的范式转变发生在一种基于获得的 CRISPR 细菌免疫系统的新工具的出现,该系统由西班牙阿利坎特大学的 Francis Mojica 发现并命名。与它的前辈不同,CRISPR 系统的编程不需要多模块蛋白质的从头构建,而只需要生成与基因组目标互补的小 RNA 序列,该序列被整合到一个不变蛋白 (Cas9) 中并作为一个引导(引导 RNA 或 gRNA)到达其基因组目标。 CRISPR/Cas9 编程代码的简单性极大地促进了其设计和构建,这使得许多实验室和最终用户可以培育出新的特定“特征”。此外,CRISPR/Cas9 架构允许同时编程多个目标(称为多路复用的功能),这可以促进表型特征的积累,大大加快改进过程。
一般来说,根据基因组中引入的修饰类型,基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑策略有 3 种。

植物中最常用的是所谓的 SSN-1 策略,它包括产生小的随机突变(indels:插入或缺失),作为目标序列中 DNA 断裂的结果,随后通过称为 NHEJ 的机制进行错误修复(非同源末端的联合)。这种策略已被证明在几个物种中非常有效,旨在通过突变基因功能的丧失来诱导新的性状。就其本身而言,被称为 SSN-2 的策略提供了更高的精度,因为它实际上包括重写一个小的基因组区域,该区域包含预定义的更改,这些更改在“供体”DNA 序列中加密,该序列与 SSN 一起转移到基因组。为此,使用称为同源重组的另一种细胞修复类型,它使用外部 DNA 模板修复基因组。最后,SSN-3 策略与 SSN-2 类似,但其目标不是引入小的“修复”,而是利用 HR 修复的许可性将“新的遗传信息”纳入精确的基因组位点以接受供体它们在其中心区域包含非同源区域的序列。 SSN-2 和 SSN-3(也称为遗传靶向策略或 GT)都扩展了遗传变异的范围以改善功能,在通过这些策略可以获得的性状类型方面实现了质的飞跃。然而,直到最近,基于同源重组的策略在植物中效率低下,这意味着迄今为止测试的许多方法都是“功能丧失”类型(SSN-1)。
在所有情况下,为了进行基因组编辑,必须将 SSN 酶(例如 Cas9)连同 gRNA 以及在适当情况下含有“新的“基因序列”被引入(SSN-2 和 SSN-3),随后从细胞或编辑过的细胞中再生出完整的植物。将这些元件引入细胞的最常用机制是由农杆菌介导的遗传转化。结果是,暂时地,转基因植物包含并表达上述元素中的每一个。然而,在后面的步骤中,对于有性繁殖的植物,T-DNA 可以通过有性分离消除,从而产生包含所需基因编辑的非转基因植物。
从生物伦理的角度和严格关注最终产品的角度来看,SSN-1 和 SSN-2 策略产生的植物与传统育种方法产生的植物几乎没有区别,因此有人认为不应将其视为转基因生物。就其本身而言,SSN-3 策略将不可避免地导致转基因生物,尽管在引入额外遗传信息的基因组的确切位置具有更高的精确度。
关于生物伦理和监管影响,最近,已经成功测试了替代机制,将核糖核蛋白复合物(Cas9 + RNAg)直接引入不同植物物种原生质体的细胞核中,从而避免使用 DNA 形式的中间体。这样,编辑过程就完全同化了化学诱变过程(后者不受OMG的调控),这样得到的植物就可以作为非转基因植物上市销售。