L'editing del genoma è un tipo di NPBT mediata da nucleasi sequenza-specifiche programmabili (SSN). Le SSN sono enzimi che causano piccole rotture nel DNA che, una volta riparate dalla cellula, possono produrre mutazioni di vario tipo a seconda del meccanismo molecolare utilizzato nella riparazione. La particolarità delle SSN applicate al miglioramento genetico risiede nella nostra capacità di programmarle con alta precisione, in modo che siano dirette a siti specifici del genoma vegetale e lì esercitino la loro attività. Questo, insieme all’abbondanza di informazioni genomiche e fenomiche generate negli ultimi anni sia in piante modello che in specie coltivate, si traduce in una capacità pressoché illimitata di generazione di nuova variabilità genetica “diretta” ad aree del genoma precedentemente individuate per il loro interesse funzionale. Questa nuova variabilità “diretta” generata dalle SSN può essere utilizzata sia per acquisire nuove conoscenze di base sia per generare nuovi caratteri di interesse agronomico. In questo secondo aspetto, la gamma di usi e applicazioni delle SSN nel miglioramento genetico delle piante è enorme e va dalla resistenza a stress biotici e abiotici, all'aumento della produttività, al miglioramento del contenuto nutrizionale, ecc.
Negli ultimi anni sono stati scoperti diversi tipi di SSN programmabili. Le SSN basate su zinc-finger nucleases (ZFN) sono note fin dagli anni '90 del secolo scorso. Più recentemente sono state sviluppate SSN basate su effettori TAL, che hanno contribuito a un salto di qualità in termini di efficienza rispetto ai sistemi precedenti. In entrambi i casi, la "programmazione" si basa sulla combinazione di più moduli proteici secondo un codice precedentemente delucidato, che richiede la modifica ex novo di una proteina multimodulare per ciascun bersaglio genomico. Sebbene lo sviluppo di nuove strategie per la sintesi e l'assemblaggio di frammenti di DNA abbia notevolmente facilitato la produzione di proteine ricombinanti, la programmazione di SSN con codici basati sulla combinazione di moduli proteici è laboriosa, costosa e non disponibile per molti laboratori.
Il cambiamento di paradigma nell'uso delle SSN è avvenuto con la comparsa di un nuovo strumento basato sul sistema di immunità batterica acquisita CRISPR, scoperto e nominato da Francis Mojica dell'Università di Alicante in Spagna. A differenza dei suoi predecessori, la programmazione del sistema CRISPR non richiede la costruzione ex novo di proteine multimodulari, ma solo la generazione di una piccola sequenza di RNA complementare al bersaglio genomico, che è incorporata in una proteina invariabile (Cas9) e funge da guida (guida RNA o gRNA) per raggiungere il suo bersaglio genomico. La semplicità del codice di programmazione di CRISPR/Cas9 facilita notevolmente la sua progettazione e costruzione, il che rende possibile a molti laboratori e utenti finali la creazione di nuovi "tratti" specifici. Inoltre, l'architettura di CRISPR/Cas9 consente la programmazione simultanea di più obiettivi (funzione nota come multiplexing), che potrebbe facilitare l'accumulo di caratteri fenotipici, accelerando notevolmente i processi di miglioramento.
In generale, esistono tre strategie di editing genetico basate su CRISPR/Cas9 a seconda del tipo di modificazioni introdotte nel genoma.
La più comunemente utilizzata nelle piante è la cosiddetta strategia SSN-1, che consiste nel generare piccole mutazioni casuali (indel: inserzioni o delezioni), come conseguenza della rottura del DNA nella sequenza bersaglio e successiva riparazione con introduzione di errori mediante il meccanismo noto come NHEJ (non-homologous end joining, l’unione di estremità non omologhe). Questa strategia si è dimostrata molto efficiente in diverse specie e mira a indurre nuovi caratteri mediante la perdita di funzione dei geni mutati. D’altra parte, la strategia nota come SSN-2 offre una maggiore precisione, poiché consiste letteralmente nel riscrivere una piccola regione genomica che incorpora cambiamenti predefiniti che sono crittografati in una sequenza di DNA "donatore" che viene trasferita al genoma insieme alla SSN. Per questo, viene utilizzato un tipo alternativo di riparazione cellulare, chiamata ricombinazione omologa (HR, homologous recombination), che ripara il genoma utilizzando un modello di DNA esterno. Infine, la strategia SSN-3 è simile alla SSN-2, ma il suo obiettivo non è introdurre piccole "riparazioni", ma incorporare "nuove informazioni genetiche" in precisi siti genomici sfruttando la permissività della riparazione HR per accettare sequenze donatrici che contengono regioni non omologhe nella loro regione centrale. Sia il SSN-2 che il SSN-3 (conosciuti anche collettivamente come strategie di targeting genetico o GT) estendono la gamma della variabilità genetica per il miglioramento funzionale, offrendo un salto di qualità nel tipo di tratti che possono essere ottenuti attraverso queste strategie. Tuttavia, fino a poco tempo fa, le strategie basate sulla ricombinazione omologa si sono dimostrate inefficienti nelle piante, il che ha fatto sì che molti degli approcci finora testati fossero del tipo "perdita di funzione" (SSN-1).
In tutti i casi, per effettuare l'editing genomico, è indispensabile trasferire l'enzima SSN (ad esempio Cas9) al nucleo di una cellula vegetale, insieme al gRNA e, se è il caso, il DNA del donatore contenente la “nuova” sequenza genetica da introdurre (SSN-2 e SSN-3), per rigenerare successivamente una pianta completa dalla cellula o dalle cellule modificate. Il meccanismo più comunemente utilizzato per l'introduzione di questi elementi nella cellula è la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium. Il risultato è, transitoriamente, una pianta transgenica che contiene ed esprime ognuno dei suddetti elementi. Tuttavia, in una fase successiva e nel caso di piante che si moltiplicano sessualmente, il T-DNA può essere eliminato per segregazione sessuale dando origine a piante non transgeniche che contengono l'editing genetico desiderato.
Dal punto di vista bioetico e concentrandosi strettamente sul prodotto finale, le strategie SSN-1 e SSN-2 generano piante praticamente indistinguibili da quelle generate con metodi di miglioramento tradizionali, e si sostiene quindi che non dovrebbero essere considerate OGM. Da parte sua, la strategia SSN-3 porterebbe inevitabilmente ad un OGM, sebbene con un maggior grado di precisione riguardo al luogo esatto del genoma in cui è stata introdotta l'informazione genetica aggiuntiva.
Per quanto riguarda le implicazioni bioetiche e regolatorie, recentemente sono stati sperimentati con successo meccanismi alternativi per introdurre direttamente il complesso ribonucleoproteico (Cas9 + gRNA) nel nucleo cellulare di protoplasti di diverse specie vegetali, evitando così l'utilizzo di intermediari sotto forma di DNA. In questo modo il processo di editing è completamente assimilato al processo di mutagenesi chimica (quest'ultimo esentato dalla regolamentazione sugli OGM), in modo che le piante risultanti possano essere commercializzate come non transgeniche.