Edycja genomu jest rodzajem nowej techniki hodowlanej, w której pośredniczą programowalne nukleazy specyficzne dla sekwencji (SSN). SSN to enzymy powodujące niewielkie pęknięcia w DNA, które po naprawie przez komórkę mogą powodować mutacje różnego typu, w zależności od mechanizmu molekularnego zastosowanego w naprawie. Specyfika SSN stosowanej w hodowli polega na tym, że jesteśmy w stanie zaprogramować je z dużą precyzją, tak aby lądowały w określonych miejscach genomu roślinnego i tam działały. To, wraz z obfitymi informacjami genomicznymi i fenomicznymi wygenerowanymi w ostatnich latach zarówno w modelowych roślinach, jak i uprawach, przekłada się na prawie nieograniczoną zdolność do generowania nowej zmienności genetycznej „skierowanej” na obszary genomu wcześniej zidentyfikowane przez jego funkcjonalne zainteresowanie. Ta nowa „ukierunkowana” zmienność generowana przez SSN może być wykorzystana zarówno do uzyskania nowej podstawowej wiedzy, jak i do wygenerowania nowych cech interesujących agronomię. W tym drugim aspekcie zakres zastosowań i zastosowań SSN w doskonaleniu roślin jest ogromny, od odporności hodowlanej po stresy biotyczne i abiotyczne, po zwiększenie produktywności, poprawę zawartości składników odżywczych itp.
W ostatnich latach odkryto różne typy programowalnego numeru SSN. SSN oparte na białkach typu palca cynkowego (ZFN) są znane od lat 90. ubiegłego wieku. Niedawno opracowano SSNs oparte na efektorach TAL, co przyczyniło się do skoku jakościowego pod względem wydajności w porównaniu z poprzednikami. W obu przypadkach „programowanie” opiera się na połączeniu kilku modułów białkowych według wcześniej wyjaśnionego kodu, co wymaga modyfikacji de novo wielomodułowego białka dla każdego celu genomowego. Chociaż opracowanie nowych strategii syntezy i składania fragmentów DNA znacznie ułatwiło produkcję białek rekombinowanych, programowanie SSN z kodami opartymi na kombinacji modułów białkowych jest pracochłonne, kosztowne i niedostępne dla wielu laboratoriów.
Zmiana paradygmatu w stosowaniu SSN nastąpiła wraz z pojawieniem się nowego narzędzia opartego na nabytym systemie odporności bakteryjnej CRISPR, odkrytego i nazwanego przez Francisa Mojica z Uniwersytetu Alicante w Hiszpanii. W przeciwieństwie do swoich poprzedników, programowanie systemu CRISPR nie wymaga konstrukcji wielomodułowych białek de novo, a jedynie wygenerowania małej sekwencji RNA komplementarnej do genomu docelowego, która jest inkorporowana do niezmiennego białka (Cas9) i służy jako przewodnik (przewodnik RNA lub gRNA), aby osiągnąć swój genomowy cel. Prostota kodu programistycznego CRISPR / Cas9 znacznie ułatwia jego projektowanie i budowę, co umożliwia wielu laboratoriom i użytkownikom końcowym wyhodowanie nowych specyficznych „cech”. Ponadto architektura CRISPR/Ca9 umożliwia jednoczesne programowanie wielu celów (funkcja znana jako multipleksowanie), co może ułatwić akumulację cech fenotypowych, znacznie przyspieszając procesy doskonalenia.
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy strategie edycji genetycznej oparte na CRISPR / Cas9 w zależności od rodzaju modyfikacji wprowadzonych w genomie.
Najczęściej stosowana w roślinach jest tak zwana strategia SSN-1, która polega na generowaniu małych losowych mutacji (indele: insercje lub delecje), w wyniku pęknięcia DNA w sekwencji docelowej i późniejszej błędnej naprawy przez mechanizm zwany NHEJ (Unia końców niehomologicznych). Ta strategia okazała się bardzo skuteczna w przypadku kilku gatunków i ma na celu wywołanie nowych cech poprzez utratę funkcji zmutowanych genów. Ze swojej strony strategia znana jako SSN-2 oferuje większą precyzję, ponieważ dosłownie polega na przepisaniu małego regionu genomowego, który zawiera predefiniowane zmiany, które są zaszyfrowane w sekwencji DNA „dawcy”, która jest przenoszona do genomu wraz z SSN. W tym celu stosuje się alternatywny typ naprawy komórkowej, zwany rekombinacją homologiczną, który naprawia genom przy użyciu zewnętrznej matrycy DNA. Wreszcie, strategia SSN-3 jest podobna do SSN-2, ale jej celem nie jest wprowadzenie małych „napraw”, ale włączenie „nowej informacji genetycznej” w precyzyjne miejsca genomu, wykorzystując permisywizm naprawy HR do przyjęcia dawcy sekwencje, które zawierają regiony niehomologiczne w swoim regionie centralnym. Zarówno SSN-2, jak i SSN-3 (znane również zbiorczo jako strategie celowania genetycznego lub GT) rozszerzają zakres zmienności genetycznej w celu poprawy funkcji, zapewniając jakościowy skok w rodzaju cech, które można uzyskać dzięki tym strategiom. Jednak do niedawna strategie oparte na rekombinacji homologicznej były nieskuteczne w roślinach, co oznaczało, że wiele z dotychczas testowanych podejść ma charakter „utraty funkcji” (SSN-1).
We wszystkich przypadkach, aby przeprowadzić edycję genomu, konieczne jest przeniesienie enzymu SSN (na przykład Cas9) do jądra komórki roślinnej wraz z gRNA i, w stosownych przypadkach, DNA dawcy zawierającym „ nowa” „sekwencja genetyczna do wprowadzenia (SSN-2 i SSN-3), aby następnie zregenerować kompletną roślinę z komórki lub komórek poddanych edycji. Najczęściej stosowanym mechanizmem wprowadzania tych elementów do komórki jest transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium. Rezultatem jest, przejściowo, roślina transgeniczna, która zawiera i wyraża każdy z wyżej wymienionych elementów. Jednak na późniejszym etapie iw przypadku roślin, które rozmnażają się płciowo, T-DNA można wyeliminować przez segregację płciową, dając początek roślinom nietransgenicznym, które zawierają pożądaną edycję genetyczną.
Z bioetycznego punktu widzenia i ściśle dbając o produkt końcowy, strategie SSN-1 i SSN-2 generują rośliny praktycznie nie do odróżnienia od tych generowanych tradycyjnymi metodami hodowlanymi, dlatego uważa się, że nie powinny być uważane za GMO. Ze swojej strony strategia SSN-3 nieuchronnie prowadziłaby do GMO, chociaż z większą precyzją w dokładnym miejscu genomu, w którym wprowadzono dodatkową informację genetyczną.
Jeśli chodzi o implikacje bioetyczne i regulacyjne, ostatnio z powodzeniem przetestowano alternatywne mechanizmy bezpośredniego wprowadzania kompleksu rybonukleoproteinowego (Cas9 + RNAg) do jądra komórkowego protoplastów różnych gatunków roślin, unikając w ten sposób stosowania pośredników w postaci DNA. W ten sposób proces redagowania jest całkowicie zrównany z procesem mutagenezy chemicznej (ten ostatni wyłączony z regulacji OMG), dzięki czemu powstałe rośliny mogą być sprzedawane jako nietransgeniczne.